Hygromycin B 潮霉素B Roche

Hygromycin B 潮霉素B Roche是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。

Hygromycin B 潮霉素B Roche作用机制:  

潮霉素B是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。 

Hygromycin B 潮霉素B Roche抗性基因: 

对潮霉素B的抗性源自编码潮霉素B磷酸转移酶(Hph)的基因。至今发现两种来源: 

?Streptomyces hygroscopicus产生的Hph抗性基因;

?Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae内质粒携带的Hph抗性基因(常用);  

生物应用: 

1)  筛选和维持培养稳定转染Hph 载体的原核细胞或真核细胞(植物细胞和哺乳动物细胞); 

2)  由于作用模式的差异,常与G418 (GeneticinTM),Zeocin™和lasticidin S联合使用,筛选稳定转染两个不同载体的细胞株;

双抗性稳定转染细胞筛选的抗生素作用机制及抗性

抗生素

抗性机制

抗性基因

哺乳动物筛选浓度

潮霉素B

干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读

Hph

200~500μg/mL

G418

干扰80S核糖体功能和抑制蛋白合成

Tn5/Tn601

100~1000μg/mL

Zeocin

掺入或者切割DNA引起细胞死亡

Sh ble

50~100μg/mL

blasticidin S

核糖体上抑制肽键形成

Bsd/BSD

3~50μg/mL

3)抗病毒剂,由于潮霉素B选择性渗透进入因病毒感染增强通透性的细胞,而且具有抑制翻译的功效;

4)作为驱虫药加入动物饲料; 

应用浓度: 

潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型,培养基,生长条件和细胞代谢率而变化。推荐使用浓度为50-1000 μg/mL,*浓度需要杀灭曲线来确定。 

哺乳动物细胞·200-500 μg/mL;细菌/植物细胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000 μg/mL; 

产品使用:

使用一:杀灭曲线确定*杀死浓度(仅作参考,因个人检测体系而异)

(1)往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞,细胞密度约50-200细胞/孔;细胞贴壁之后,往每孔加入含不同浓度(如50-1000μg/mL,至少5个浓度)潮霉素B的200μL新鲜培养基;

(2)37℃,5% CO2培养箱孵育细胞10-14天;

(3)培养5-7天后更换新的培养液,培养液内含有相应浓度的潮霉素B;

(4)10-14天后使用细胞增殖方法如MTT,CCK-8等评估细胞活力;也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的zui小浓度为*筛选浓度。

使用二:筛选稳定转染细胞

(1)        对于贴壁细胞,直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基,然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml;对于悬浮细胞,无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基,然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基;

(2)        5-7天后,如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基;

(3)        再孵育细胞5-7天;

(4)        10-14天孵育后,培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一,更换不含潮霉素B的新鲜培养基。 

应用实例:

物种

细胞系/株

质粒/载体

筛选浓度

E.Coli

HB101/XL1-Blue/K802

pEX-2

95~950 μM 

Rice

Protoplast

pTRA132/pTRA141

95~285 μM

Barley

Callus

binary vector

50 μg/mL

Aspergillus nidulans

G191/pDJB3-1

pDH25

250 ,>1000

Chicken

B cell line DT40

N/A

1500 μg/mL

Human

HEK293

pUHD10-3

50 μg/mL

Mouse

J1 ES

pBS524

200μg/mL

Human

HMEC-1

pCEP-4

200 μg/mL

Drosophila

S2

pAc, pCoHygro

500 μg/mL

保存方法:溶液直接存放在2℃~8℃,至少存放1年。