NEBNext® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 UMI 接头，适用于 RNA）

·接头引物可用于 PCR-free 的文库扩增 

 ·  高效稳定的连接效率

 ·  更灵敏地检测低频单核苷酸变异（SNV）

 · 可支持更高通量

 用于 Illumina^® 平台的 NEBNext^® 多样本接头引物是 NEBNext^® 文库制备系列产品的重要组成部分，有多种不同的产品可用于 NEBNext^® 产品或其它标准的 Illumina^® 平台兼容的文库制备流程。该产品经设计和优化，适用于包括 PCR-free 在内的 DNA 测序流程。这些独特的双端检索引物接头还分别包含一段唯一的分子标签序列（UMI），以便识别和删除扩增文库中的 PCR 错误或重复。提供 96 个独特的、预混的含有 UMIs 的接头引物，包装在一个一次性的密封着可穿刺的铝箔封板膜 96 孔板中。PCR 扩增需要的通用引物也包含在内。

可提供适用于 RNA 测序的 NEBNext® Unique 双端 UMI 接头（NEB #E7416），也可提供单端、双端和 Unique 双端引物以及优化的接头。

NEBNext^® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 UMI 接头，适用于 DNA）可实现更高的连接效率。A）以 100 ng、250 ng 和 500 ng 的人 NA19240 基因组 DNA（Coriell Institute for Biomedical Research）为起始样本，使用 NEBNext^® Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒（NEB #E6177）和图中相应供应商提供的接头引物制备文库，不进行 PCR 扩增。连接后，使用 SPRIselect 磁珠进行两轮纯化，使用 NEBNext^® 文库定量试剂盒（NEB #E7630）对文库进行定量。B)以 100 ng NA19240 基因组 DNA 为起始样本，使用 Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒在 96 孔板中制备 90 个文库，供应商提供的 30 个接头引物如图所示，不进行 PCR 扩增。两轮磁珠纯化后，进行 qPCR 定量。

NEBNext^® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 UMI 接头，适用于 DNA）可更灵敏地检测低频变异。AcroMetrix 肿瘤 Hotspot Control DNA（Thermo Scientific^® #969056）作为突变 DNA 源（>500个突变，等位基因频率为 5-35%），以不同比例与 NA19240 基因组 DNA 混合，产生一系列不同的等位基因频率。使用 NEBNext® Ultra II DNA 文库制备试剂盒（NEB #E7645）和 NEBNext^® Unique 双端 UMI 接头制备文库，并使用 Twist Bioscience^® 的 152 个基因的定制 panel 对所有样本进行多重杂交捕获。文库使用 Illumina NovaSeq^® 测序，Reads 被降采样至 1.1 亿，并使用 BWA MEM（0.7.17）比对至 hg38。在不使用 UMI 序列或构建 UMI 共有序列（Fgbio 0.8.1）的情况下，使用 MarkDuplicates（Picard 2.20.6）分析比对上的 reads。使用 Strelka2（2.9.10）从最终的 BAM 文件中分析体细胞突变。（A）当使用 UMIs 删除重复序列，所得的 SNV 总数和正确的数量都增加。（B）用 UMI 进行共有序列比较，能提高检测灵敏度。等位基因频率越低，UMIs 在 SNV 检测中的优势就越大。

 NEBNext^® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 UMI 接头，适用于 DNA）

·  高效稳定的连接效率

·  可支持更高通量

· 专为 RNA 文库优化

·  更准确地测定转录本丰度

 用于 Illumina^® 平台的 NEBNext® 多样本接头引物是 NEBNext^® 文库制备系列产品的重要组成部分，有多种不同的产品可用于 NEBNext^® 产品或其它标准的 Illumina^® 平台兼容的文库制备流程。该产品（Unique 双端 UMI 接头，适用于 RNA，NEB #7416）为 RNA 测序流程设计和优化。这些独特的双端检索引物接头还分别包含一段唯一的分子标签序列（UMI），包含一个独特的分子条形码（UMI）序列，以便更准确地分析转录组。通用引物也包含在内。

可提供适用于 DNA 测序的 NEBNext® Unique 双端 UMI 接头（NEB #E7395），也可提供单端、双端和 Unique 双端引物以及优化的接头。

NEBNext^® Unique 双端 UMI 接头具有同样有效的连接和随后扩增。

A：以通用人参考 RNA（Agilent ＃740000）为起始样本，使用 NEBNext® Poly(A) mRNA 磁性分离模块（NEB #E7490）富集后，使用 NEBNext^® Ultra II RNA 定向文库制备试剂盒（NEB #E7760）制备 96个文库。使用 Agilent Tapestation 4200 评估建库产量，通过将单个文库产量除以 96 个所有文库的平均产量对文库进行标准化。所有 96 个 Unique 双端 UMI 接头的一致性和连接效率都很高。每个条形图代表至少 2 个技术重复的平均值。

B：NEBNext® Unique 双端 UMI 接头具有均一的聚类效率。文库使用 Illumina NextSeq® 500（PE70）测序。每个文库预计占测序 reads 总数的1.04%。通过将实际的 reads 数除以预期的 reads 数对文库产量进行标准化。96 个 Unique 双端 UMI 接头均未出现偏差。

相较于其它 UMI 接头竞品，NEBNext Unique 双端 UMI 接头性能更优越。

以通用人参考 RNA 为起始样本，使用 NEBNext® Poly(A) mRNA 磁性分离模块（NEB #E7490）富集后，使用 NEBNext® Ultra II RNA 定向文库制备试剂盒（NEB #E7760）制备文库。

A：以 10 ng、100 ng 和 1,000 ng 的总 RNA 为起始样本，图中显示了三个重复的平均文库产量。使用 NEBNext® Unique 双端 UMI 接头或 IDT xGen 双端接头进行接头连接。使用 Agilent Tapestation 4200 评估最终建库产量
B：文库使用 Illumina NextSeq® 500（PE70）测序。Reads 被降采样（seqtk）至 500 万，并使用 HISAT 2.1 比对至 GRCh38 参考基因组。使用 fgbio（AnnotateBamWithUmis）添加 UMI 信息，并使用 MarkDuplicates（Picard 2.18.2.1）标记含有 UMI 的 reads 和检测重复率。NEBNext® Unique 双端 UMI 接头产生的文库产生的重复更少。

NEBNext 接头是为 DNA、ChIP DNA 和 RNA（不包括 Small RNA）文库构建而设计的，能够确保接头的高效连接及文库的高产量，并且最大限度的减少接头二聚体的形成。NEBNext 接头包含一个特殊的发卡环状结构，能够更高效的和经末端修复的带 dA 尾的 DNA 结合。环状结构包含一个 U，当 U 被 USER 酶（由 UDG 和内切酶 VIII 组合而成）切掉后，环状结构打开，使它可以成为 PCR 的反应底物。检索序列通过 PCR 引入文库，从而实现了多样本的制备。NEBNext 接头引物不仅能够用于 NEBNext 产品，也可以用于其它的兼容 Illumina 标准平台的文库制备方法。

 每个试剂盒都通过对基因组 DNA、ChIP DNA 和 mRNA 进行文库构建，并在 Illumina 平台测序进行验证。

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