Qiagen 12381 EndoFree Plasmid Mega Kit

纯化得到至多10 mg的无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA
•纯化得到的DNA内毒素水平低于0.1 EU/µg
•纯化流程快,同时去除内毒素
•获得高产量、高拷贝质粒DNA
•使用LyseBlue,获得*的裂解和高产量的DNA

纯化得到至多10 mg的无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA

  • 纯化得到的DNA内毒素水平低于0.1 EU/µg
  • 纯化流程快,同时去除内毒素
  • 获得高产量、高拷贝质粒DNA
  • 使用LyseBlue,获得*的裂解和高产量的DNA

EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术,可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges过滤快速澄清裂解液。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度,适合超转染级纯的应用。EndoFree Plasmid Buffer Set可用于制备10次mega规模或5次giga规模转染级纯质粒或科斯质粒DNA制备。

 

Performance

EndoFree Plasmid Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中,不需要额外步骤,也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Mega-Giga Cartridge过滤细菌裂解液,并使用重力流QIAGEN-tip阴离子交换柱纯化质粒DNA。产量可达10 mg(Giga)、2.5 mg(Mega)、500 μg(Maxi)DNA。纯化的DNA无内毒素(<0.1 EU/µg DNA)。

选用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit纯化低拷贝质粒和科斯质粒,将会得到更好的效果,因为后者需要较大的培养体积,而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。

EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素,内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染(参见”Plasmid purification method versus transfection efficiency”和”Plasmid purity versus transfection efficiency”及表”Endotoxin levels in plasmid preparations”和”EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells”)。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究和其他敏感应用。

 

质粒制备中的内毒素水平*
质粒制备方法 内毒素(EU/µg DNA) 平均转染效率
EndoFree Plasmid Kit 0.1 154%
QIAGEN Plasmid Kit 9.3 100%
2x CsCl 2.6 99%
Silica-gel slurry 1230.0 24%
* 宿主菌:大肠杆菌DH5α  质粒:pRSVcat。
† 1  ng LPS = 1.8 EU。 
 根据表中数据计算 。
无内毒素DNA转染原代细胞的高转染率*
DNA纯化方法 转染细胞比例
EndoFree Plasmid Kit 21.0% ± 0.93
QIAGEN Plasmid Kit 8.1% ± 0.57
Silica-gel slurry 5.2% ± 0.74
* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2(CLONTECH),pEGFP-N2由所示的方法制备。使用Effectene Transfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率,由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。(数据由C. Chew and J. Parente提供,Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.)

Principle

纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法(参见”Endotoxin levels in plasmid preparations”)。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤,获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置,用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可*去除SDS沉淀,清除细菌裂解液,相比离心可大量节约时间,减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用内部真空方式轻松高效的清除大量细菌裂解液(注意:该试剂盒不包含瓶子)。

QIAGEN-tips中*的阴离子交换树脂(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)专为核酸纯化而开发。它的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips,最大限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质,如苯酚,CHCl3,溴化乙锭和CsCl,最大限度地减少对用户和环境的危害。

内毒素,又称脂多糖或LPS,是大肠杆菌等革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分,如大肠杆菌(参见”Bacterial cell wall”)。内毒素在质粒裂解纯化过程中释放出来,并显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率。此外,内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂,影响转染实验中质粒DNA的摄取。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞发生非特异性免疫反应,从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类,如IL-1和前列腺素等的合成。总体而言,内毒素在转染实验中是不可控变量,影响结果的可重复性,使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中,内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联,干扰研究。

Procedure

在碱性条件下,细菌细胞裂解,使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后,将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上,在适当的低盐和pH条件下,质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质,超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱(参见”QIAGEN Plasmid Kit procedures”)。最后DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。

Applications

使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用,包括:

  • 转染,包括原代、敏感以及悬浮细胞
  • 基因治疗研究
  • 基因沉默
  • 显微注射

 

Features

Specifications

应用 Transfection, gene therapy
起始样本体积 2.5 liters culture volume
质粒类型 High-copy, low-copy, cosmid DNA
处理 Manual (vacuum)
每次处理样本量;通量 1 sample per run
技术 Anion-exchange technology
每次运行时间或处理样本数 310 min
产量 <10 mg

Qiagen12181/12183QIAGEN Plasmid Mega Kit

纯化至多10 mg转染级质粒或柯斯质粒DNA
•纯化得到相当于连续2次CsCl梯度离心得到的DNA纯度
•高产量质粒DNA
•经济的制备方法
•使用LyseBlue,获得*的裂解效果和大的DNA产量

纯化至多10 mg转染级质粒或柯斯质粒DNA

  • 纯化得到相当于连续2次CsCl梯度离心得到的DNA纯度
  • 高产量质粒DNA
  • 经济的制备方法
  • 使用LyseBlue,获得*的裂解效果和最大的DNA产量

QIAGEN Plasmid Kits应用重力流阴离子交换柱纯化转染级质粒DNA。该试剂盒可纯化获得至多10 mg的质粒DNA。离心获得澄清的裂解产物和异丙醇沉淀。
 

Performance

QIAGEN Plasmid Kit利用重力流QIAGEN阴离子交换柱技术高效纯化质粒DNA。产量可达10 mg(Giga)、2.5 mg(Mega)、500 µg(Maxi)、或100 µg(Midi)高拷贝质粒DNA(培养体积取决于质粒拷贝数、插入片段大小、宿主菌株和培养基。)QIAGEN Plasmid Kits纯化的质粒DNA适合多种应用,如:转染(参见”Transfection efficiency versus plasmid purification method”)、克隆和体外转录。

Principle

QIAGEN-tips内*的阴离子交换树脂专为纯化核酸设计。它*的分离特性,使纯化的DNA的纯度相当于连续2次CsCl梯度离心得到的DNA纯度。预装的QIAGEN-tips利用重力流原理工作,缩短了纯化质粒的手动操作时间。整套QIAGEN质粒纯化体系避免苯酚、CHCl3、溴化乙锭和CsCl等有毒物质,减小对使用者和环境的危害。

Procedure

使用QIAGEN Plasmid Kits,细菌裂解物通过离心澄清。澄清后的裂解物上样到阴离子交换柱,质粒DNA在适当的低盐条件和pH条件下与树脂进行选择性结合。RNA、蛋白质、代谢产物和和其它低分子量杂质用中盐洗涤液去除,用高盐缓冲液洗脱纯质粒DNA(参见”QIAGEN Plasmid Kit procedures”)。得到的DNA用异丙醇沉淀浓缩和脱盐后,离心收集。

Applications

QIAGEN Plasmid Kits纯化质粒DNA适合多种应用,如:

转染

克隆

PCR

体外转录

Features

Specifications

应用 Transfection, cloning, sequencing, capillary sequencing etc.
起始样本体积 2.5–5 liters culture volume
质粒类型 High-copy, low-copy, cosmid DNA
处理 Manual (centrifugation)
每次处理样本量;通量 1 sample per run
技术 Anion-exchange technology
每次运行时间或处理样本数 320 min
产量 <10 mg

 

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