上海金畔生物科技有限公司常年供应“线粒体提取试剂盒”

线粒体提取试剂盒使用说明

 一，试剂盒组份

二，说明

线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。

三，操作步骤

1. 样本处理

a. 组织匀浆：称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次；

b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要5 × 10⁷个细胞，加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000× g 离心5 min；

3. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000× g 再次离心5 min。

4．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

5. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；

6．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

6. 用50 -100μL Store Buffer 或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。

四注意事项：
1. 为保证获得完整的线粒体，*是全程低温操作。第二是快速。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的zui关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。

五储存：四周内使用可4℃储存，长期置-20℃

转速与离心力换算

G＝1.11×（10^-5）×R×[rpm]^２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；

 [rpm]^２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。

上海金畔生物科技有限公司供应抗体稀释液(一抗稀释液) Jinpan P1140量大优惠，咨询 ：

抗体稀释液（一抗稀释液） Jinpan P1140

上海金畔生物科技有限公司供应抗体稀释液（一抗稀释液） Jinpan P1140量大优惠，咨询 ：      2743691513

上海金畔生物科技有限公司供应0.1%胰蛋白酶液消化液 Jinpan P0930量大优惠，咨询 ：

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常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。

问：为什么要进行抗原修复：

答：福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。

抗原修复中柠檬酸缓冲液的配制方法：

A液：枸橼酸，C₆H₈O₇.H₂O，21.01g 加水定容至1000ml；

B液：枸橼酸钠，C₆H₅Na₃O₇.2H₂O, 29.41g 加水定容至1000ml;

使用时： A液9 ml, B液41 ml，加水至500ml，即可配成工作液。

抗原修复（Antigen retrieval ，AR）技术，是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。抗原修复能zui大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施。本文的目的是概述AR-HIC的发展、应用和标准化。

一、       AR技术
加热AR技术

微波加热方法. 在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧（化）物酶，石蜡切片经蒸馏水冲洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用微波炉加热5或10分钟（注意防止切片干躁）。有时在加热5分钟后，间隔1分钟，再加热5分钟（在*个5分钟后检测液体高度）。加热后，从微波炉取出塑料Coplin缸，冷却15分钟。片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟，才进行IHC染色。为了保持*的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。

微波（MW）加热过程如下：在盒内放入200ml柠檬酸缓冲液（PH6.0±0.1），并盖上带有小孔的盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，有作者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率800W[3]，微波炉选用解冻档的国产家用微波炉（根据目前的研究,建议用医用微波炉），中档继续处理10-20分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次3分钟。
尽管有少数作者[4]认为经高温后冷却这一步省略。在我们观点，15分钟的冷却必须的几点理由：1、如这一步省略，对于有些抗体而言，会降低AR-IHC染色强度。2、突然从高温到低温可导致组织片掉片。3、可能引起形态学的变化。
  单纯加热方法.  将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉（600W）上加热至沸腾，并持续10min 。Shi等人[2]用单纯加热方法与微波加热方法比较IHC染色强度，显示两种方法导致相同的染色强度。
  高压加热方法.  Shin等人[5]发展了含水高压锅煮沸方法，来增强福尔马林固定的脑组织tau蛋白免疫反应性。将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续2min，压力锅离开热源，加热长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟，时间过长可能会使染色背景加深。现试剂公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法，这几年的实践表明，采取此方法可避免假阳、阴性，使IHC染色效果更佳。
非加热AR技术
   非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键，修复抗原。

胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05％或0.1％PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可；或用0.125%的液体胰酶。将切片放入湿盒内37oC温箱中消化18-20分钟。
    胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶；

链霉蛋白酶消化法 . 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1％，消化时间20min。
    抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。
    总之,以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。前人的研究表明，温度高修复时间短[6]。解放军第251医院根据临床病理诊断、鉴别诊断和研究的实际需要，在抗原修复方法规范研究和应用的基础上，创用了胰蛋白酶—尿素联合消化技术、盐酸水解暴露抗原技术和MW—表面活性剂Triton X—100（MW—TX）修复抗原技术 [7] 。抗原暴露或抗原修复方法较多，其中发MW—枸橼酸缓冲液使用较多，效果。MW修复抗原的方法是石蜡切片脱蜡、水洗后放入修复液中，用250W的输出功率2X5min，待冷却至室温按常规处理。目前AR过程已成功应用在BioTek全自动免疫组化染色仪中。

二、AR应注意的问题

加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，

AR液的PH值、浓度、化学成分也是重要的影响因素之一。

使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准[9]。Shi等人[10]强调修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要,实验中我们也发现要获得满意结果必须选择抗原修复液的zui适PH值。在常规石蜡切片做AR-IHC，采用不同浓度的Alcl3液做AR液，发现4%的Alcl3取得的染色[11]。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。郑辉等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L Tris-HCL缓冲液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修复抗原，发现其阳性强度逐渐增强。

高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决，有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示。对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内，例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用该方法时一定小心，对结果的判断也要客观地作出分析，侯宁等人发现端粒酶逆转录酶（TRT）经过抗原修复与不经过抗原修复，其染色效果明显不同，后者的阳性率明显高于前者[8]。操作中还应注意如下问题：
1、热处理后应注意自然冷却。
2、热处理时要防止切片干燥。
3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。
4、一批抗原的检测其温度和时间一定保持*。
5、注意形态学结构的改变（一般经高温修复后胞浆会明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻）。
6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。

用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索确定。使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶则主要用于细胞间质抗原的检测，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。一般来言，消化时间和组织固定的长短呈正比。在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应[6]。

三、AR的临床应用。
   上个世纪九十年代早期，随着AR技术的发展，IHC应用在常规处理火胶棉包埋的人类颞骨上，从分子水平上了解人类发病机理和病理生理学，创立了一个新的领域[13]。使用AR方法，在常规处理石蜡切片上评估IC5和ID15单克隆抗体的免疫组化染色[14]。 Charalambous. C等人 [15]强烈推荐MW-AR-IHC方法检测R-S细胞的CD30。AR技术成功应用于原位杂交[16]。利用加热AR-IHC技术，在福尔马林固定、石蜡组织切片上用抗毒素#4350检测nestin[17]。采用抗复技术，在人类上皮、神经、神经内分泌组织中免疫组化定位DCC蛋白[18]。AR-IHC已广泛应用于临床的研究中。
四、AR的标准化和发展
   抗原修复的确切原理尚不十分清楚，根据国内外文献报道，推测可能是：1、溶解、洗脱变性蛋白。2、水解作用。3、微波场内离子或极性分子直接碰撞的修复作用[7]。抗原修复是否可能？理论上研究尚未清楚，但是以高温、高压、对常规石蜡切片进行抗原修复处理经验表明，可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出现假阳性。
    诊断IHC上的AR技术及其在基础领域的研究已被为数众多的文献和比较多的综述所阐述。此领域的调查目的：从分子生物学诊断常规上，在石蜡组织中检测核酸和蛋白质新途径的可能性，从而形成新兴的分子形态学。一些新的途径必须建立标准化的原则和提高其重复性。[19] 。目前我国病理科大多数医院病理科尚未在IHC、AR上标准化，国外已广泛进行进行AR的标准化及IHC标准化[20]。例如在建立新的修复液方面，针对不同的抗体预定义加热条件和液体浓度、PH值、化学成分，从而推动AR的标准化。
    现AR技术已广泛应用于免疫组化（IHC）各领域的研究，例如在诊断病理学和IHC的标准化方面。对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用AR后绝大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上，对IHC回顾性研究和临床病理IHC鉴别诊断，肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估具有积极的意义。

上海金畔生物科技有限公司供应膜再生液 Jinpan P0380量大优惠，咨询 ：

 膜再生液 Jinpan P0380

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膜再生液有些公司叫做一抗二抗去除液，用于对同一张膜进行多次 Western Blot检测。

在室温条件下，将用过的膜浸泡在膜再生液
30-60分钟，可在不影响抗原蛋白的情况下清除膜上结合的抗体。随后，可以使用不同的抗体
进行下一轮 Western Blot实验，因而可利用同一张膜进行多次蛋白检测。适宜从少量样品多次
检测多种不同蛋白质。即使样品量并不匮乏，采用这一策略多次检测同一张膜上的蛋白，能省去
给药处理、蛋白电泳和膜转移等耗费性步骤。
本产品特点是：无毒无害，室温下使用，室温下保存；可对同一张膜进行 10次以上的
Western Blot检测。 适用于清除硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上结合的抗体，不影响抗原蛋白。

1、膜再生的实质是在不影响膜上结合的抗原的条件下，将与抗原分子结合的一抗和二抗洗脱下来。有许多因素影响抗体从膜洗脱，如膜类型、抗体类型和浓度及其与抗原结合特性。按下面的说明优化再生液中孵育膜的时间至关重要。
2、确定膜上抗体是否去除与优化再生液孵育膜的时间：用 ECL 荧光工作液孵育再生后的膜约 1
分钟，然后进行 X光胶片曝光并显影，可确定膜上的抗体是否*去除。如胶片上显示条带，表
明抗体未*去除，应继续将膜浸泡在再生液中另外孵育 30-60 分钟。然后再次 ECL 检查膜上抗
体是否去除。重复此步骤直到抗体*去除并确定*孵育时间。
3、由于至今尚不清楚的原因，使用脱脂奶粉封闭的膜要比使用 BSA封闭的膜上的抗体更容易被
洗下来。因此准备进行再生的膜，应该使用脱脂奶粉而不是 BSA封闭。
4、尽量避免使用干燥保存的膜，干的膜上的抗体很难被洗干净。

上海金畔生物科技有限公司供应膜封闭液 Jinpan P0370量大优惠，咨询 ：

膜封闭液 Jinpan P0370

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我公司生产的Western Blot膜封闭液采用经典的脱脂奶粉加入PBS本制，加入侵。02%的叠氮钠，适于在Western Blot实验中封闭转印膜上非蛋白质结合部位，减少一抗及二抗蛋白的非特异性结合，将实验背景降到zui低。该封闭液对 Nitrocellulose、PVDF、尼龙膜等各种转印膜均有较强的封闭效果。

此试剂一般现订现生产，客房拿到手后须一个月内使用。为节省成本，本产品一般可反复使用两到三回。