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产品资料 – DNA聚合酶与扩增技术 – qPCR & RT-qPCR
Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX） 收藏
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#M3029E
2000 rxns
26,279.00
无
无
无
无
无
#M3029L
500 rxns
8,379.00
无
无
无
无
无
#M3029S
200 rxns
3,719.00
有
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特性
Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）可精准检测目标 RNA，多重扩增检测性能优异，一次可检测多达 5 个靶标。
特性
• 适用于不需要 ROX 参比染料的仪器
• 4X 浓度的预混液可增加样品加入量，提高 RT-qPCR 灵敏度
• 一次可检测多达 5 个靶标，增加检测通量
• Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用，提高反应特异性及稳定性，并可室温建立体系
• 预混液中包含热敏 UDG 和 dUTP，防止模板残留污染
• 无干扰的可见示踪染料避免加样错误
• 点击 COVID-19 research 了解 NEB 如何将多种 RT-qPCR 病毒检测方法用于新冠研究
概述
Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）用于探针法实时荧光定量检测靶标 RNA。首先反转录酶将 RNA 转化为 cDNA，然后 DNA 聚合酶对 cDNA 进行扩增，完成靶标的实时荧光定量 PCR（qPCR），整个过程在单管内一次性完成。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。
Luna 探针一步法 RT-qPCR 预混液，含 UDG（无 ROX）为 4X 浓度，因此在靶标 RNA 量极低的应用中（例如：病原体检测），可提高样品加入量。通过对 5 个靶标进行不同浓度的线性、灵敏度检测，显示该产品在多重检测中性能更优。该预混液将一步法 RT-qPCR 所需组分整合到单个试管中，包括：Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA 聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用，可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性，最佳反应温度为 55°C。该剂型不含参比染料，适用于不需要 ROX 参比染料的仪器（如需 ROX 矫正，可添加 ROX）。
RT-qPCR 的高灵敏度使得避免 DNA 污染尤为重要。由于先前扩增产物可作为后续反应的底物，因此反应体系加入 dUTP 和热敏 UDG 可防止模板残留污染。热敏 UDG 超过 50°C时会完全失活，因此对 qPCR 性能没有影响。
图 1：使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）检测病毒 RNA
使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）对 SARS-CoV-2（N1 基因）、Zika（POLY 基因）、Dengue（E 基因）、Chikungunya（E2 糖蛋白基因）进行 RT-qPCR 检测。配制 20 ul 反应体系，对 5-log 浓度梯度样品（100，000–10 拷贝/反应）进行扩增性能评估，实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。扩增模板为：新冠状病毒（SARS-CoV-2）合成 RNA Control 2（Twist Biosciences，SKU：102024）、寨卡病毒（ZIKV）合成 RNA（ATCC® VR-3252SD™）、2 型登革热病毒（Dengue）合成 RNA（ATCC VR-3229SD™），基孔肯雅病毒（Chikungunya）合成 RNA（ATCC VR-3246SD™），上述模板分别稀释于 10 ng Jurkat 总 RNA（BioChain，#R1255815-50）中。结果显示：所有病毒靶基因扩增的灵敏度和线性度都非常理想。
图 2：Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG，含或不含 ROX 剂型多重扩增性能一致
使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG，含或不含 ROX 剂型（NEB# M3019 和 NEB # M3029）对 5 log 浓度范围（100 ng至10 pg）的 Jurkat 总 RNA 进行多重 RT-qPCR，实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。分别使用两种 Luna 试剂对 5 个人源靶基因制作扩增标准曲线。配制 20 μl 反应体系，其中引物和探针浓度均为 200 nM，使用产品推荐的循环条件。如 B 图所示，两种 Luna 试剂的 ACTIN（使用 Texas Red 标记探针）标准曲线重叠，这说明在没有 ROX 参比染料的情况下，扩增性能良好。如 C 图所示：针对 5 个靶基因的多重线性检测，均展现出良好的扩增效率和 R2 值。
图 3：探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG，含或不含 ROX 剂型均可得到高质量结果
两位实验人员分别按照操作说明书，使用 Bio-Rad CFX96 实时荧光定量仪器，用两种荧光定量试剂盒分别对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标（通过不同颜色显示）进行一步法 RT-qPCR 测试。反应结果就以下方面进行评估：扩增效率、低样品量检测能力及无模板扩增值（ΔCq=无模板对照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq）。此外，基于前面的度量值（质量得分）还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量。结果显示：Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）（NEB #M3029）和 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（NEB #M3019）落在绿框里的结果数量相同，即两者检测性能一致。
该预混液包含无荧光的可见蓝色可见示踪染料，有助于透明管加样。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠，也不会干扰实时检测。
图 4：Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）包含无干扰的可见蓝色示踪染料可避免加样错误
