日度归档：04/27/2024

GoldView核酸染色剂（EB替代品） D0025

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上海金畔生物科技有限公司供应GoldView核酸染色剂(EB替代品) Jinpan D0025量大优惠，咨询 ：

  GoldView核酸染色剂（EB替代品） Jinpan D0025

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GoldView（GV）是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之*相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView™即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

 

　　由于未发现GoldView™有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。

　　概 述

　　GoldView™是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之*相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。

　　通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Goldview™代替EB不失为一种明智的选择。

　　使用方法

　　1. 将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。

　　2. 加入5µl GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。

　　3. 冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶*凝固后上样电泳。

　　4. 电泳完毕在紫外灯下观察。若使用数码相机照相记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。

　　注意事项

　　1. 胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。

　　2. 加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。

　　3. 通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。

　　4. 虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。

6×RNA loading buffer R0921

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上海金畔生物科技有限公司供应6×RNA loading buffer Jinpan R0921量大优惠，咨询 ：

6×RNA loading buffer Jinpan R0921

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试剂组成：0.5M EDTA pH8.0，甘油，溴酚蓝

此产品是将6×DNA loading buffer经过DEPC处理高压后而成。

使用时，可以在PE手套上，取1ul 6×RNA loading buffer再加入5ul RNA混匀即可上样。

此RNA loading buffer只适合于常规的RNA琼脂糖，高电压（250V），快速电泳，在RNA来不及降解时就电泳结束了。如果要做RNA甲醛变性胶电泳的话，可选用4×甲醛变性胶上样缓冲液。

 

 

 

福尔根（Feulgen）DNA 染色液 C0620

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福尔根（Feulgen）DNA 染色液 Jinpan C0620

 

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福尔根（Feulgen）染色液说明书

反应原理：

DNA 经酸（1mol/L HCl）水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与 Schiff 试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有 DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基（醌基是一个具有颜色的发色团），所以含有 DNA 的部位，呈紫红色。而RNA用此法处理后则分解。

       试剂组成

规格

保存条件

Schiff试剂

100ml

2-8℃避光

重亚硫酸盐溶液

100ml

2-8℃避光

保质期：2-8℃避光6个月。

操作步骤

本染色液采用经典方法配制，染色方法可参考文献或者实验室留传下来的方法，或者参考下面的方法。

处理准备标本，同时准备60℃的１Ｍ的盐酸溶液。

１．切片脱蜡入水（洋葱表皮等类似标本，固定，梯度乙醇后入水）。

２．切片放入60℃的 1M的盐酸溶液中约5-15分钟（水解时间因标本及固定液不同而有差异，）。

３．滴加或者浸入Schiff试剂，反应30-60分钟（此步为避光反正，在通风处，用完试剂请马上盖严）。

４．吸干或者甩去Schiff试剂（如果不用重亚硫酸盐溶液洗，此步可直入水冲洗）

５．用重亚硫酸盐溶液清洗,，用完盖严（一般此步可省，直接用蒸馏水洗）。

６．在蒸馏水中充分冲洗。

7．封片（要保存染色结果，请经酒精脱水，二甲苯透明并封片）。 如果只简单的立刻观察，可直接在有少量水的情况下压片。显微镜观察。

注意事项

1．此试剂为接到订单后我公司再配制，保质期一般为6个月。但因为经常开盖等原因造成SO2流失，试剂保质期会变短，如果染色结果不佳，可适当加入少量重亚硫酸钠（钾），加入量一般为0.1g/L

2．虽然Feulgen法是DNA的特异染色方法，但如果延长水解时间并在室温下进行反应， Schiff试剂也与醛、酮、醇和缩醛磷脂起反应，因此用Feulgen法检测DNA时必须严格控制盐酸水解的时间和温度。为减少假阳性和非特异性染色必须做对照实验。

３．由于Schiff试剂能与醛基结合，故不能用含醛的固定液固定组织，常用Carnoy固定液。Bouin液不适用于Feulgen反应，因为固定液中含较多的酸，可将DNA水解，影响染色反应。

 

 

6×DNA loading buffer D0032

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6×DNA loading buffer Jinpan D0032

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6×DNA loading buffer  配制量：100ml

试剂组成：0.5M EDTA pH8.0，甘油，溴酚蓝和二甲苯青

配方：           0.5M EDTA pH8.0            6ml
甘油                              40ml
溴酚蓝                          0.05g

充分溶解后，用灭菌水定容至100ml，RT贮存。

使用时，可以在PE手套上，点1ul loading buffer再加入5ulDNA混匀即可上样。实际使用时加入量并没那么精确，大概加一点就可以了。

50×TAE 缓冲液 D0021；合肥供应50×TAE 缓

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50×TAE 缓冲液 Jinpan D0021

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50×TAE 缓冲液

试剂组成：Tris碱，0.5 M EDTA和冰醋酸

配方（1L）：242g        Tris

  100ml        0.5 M EDTA（pH8.0）

  57.1ml       冰醋酸，

此产品经滤纸过滤。

使用时，直接用水稀释成1×。取20ml 50×TAE 缓冲液，加水补足到1L，混匀就可以用。

注：

1 此溶液可以用双蒸水稀释。

2此溶液非无菌。

5×TBE 缓冲液 D0020；济南供应5×TBE 缓冲液

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5×TBE 缓冲液 Jinpan D0020

 

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5×TBE 缓冲液

试剂组成：Tris碱，硼酸和0.5M EDTA

配方（1L）：54g    Tris

        27.5g        硼酸

        20ml         0.5M EDTA（pH8.0）

此产品经滤纸过滤。

使用时，如果用于琼脂糖电泳，可以稀释10倍，配成0.5×使用。如果用于PAGE，配胶时加入量为1/5（配10ml胶加入2ml），电泳依旧可以使用0.5×的。此产品也可以配成10×，但配好后不太稳定，溶液产生沉淀。

注：1 此溶液可用双蒸水稀释。

2 此溶液非无菌。

40%丙烯酰胺/甲叉溶液（19:1） D0031

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40%丙烯酰胺/甲叉溶液（19:1） Jinpan D0031

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此试剂为丙烯酰胺和甲叉的混合物，每100ml 含有丙烯酰胺（Acrylamide）38g， 甲叉双丙烯酰胺（N,N-Methylene Bisacrylamide ）2g。避光2-8度保存。一年有效。

4×甲醛变性胶上样缓冲液 R0926

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4×甲醛变性胶上样缓冲液

配方（10ml）：
4.0ml    10×MOPS 缓冲液
3.1ml    甲酰胺
2.0ml    100%的甘油
720ul    37%的甲醛
80ul     0.5M EDTA（PH 8.0）
5mg     溴酚蓝
100ul    DEPC水
混匀，样品管级吸头经过处理后分装。-20℃保存。常用时可2-8℃存放。

使用方法：取6ul RNA样品加入2ul上样缓冲液混匀上样。

如果只是进行普通的RNA快速电泳，可选用6×RNA loading buffer。常规的琼脂糖，高电压（250V），快速电泳。

 

10×MOPS 缓冲液 R0920；郑州供应10×MOPS

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10×MOPS 缓冲液 Jinpan R0920

 

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10×MOPS 缓冲液

此产品用于RNA电泳。无DNase/RNase

试剂组成：MOPS，乙酸钠，0.5MEDTA和NaOH

配方（1L）：      41.86g         MOPS

                4.1g           乙酸钠

               20ml           0.5mol/L EDTA（pH8.0）

                *溶液后用2mol/L NaoH调整pH至7.0。再定溶分装。

分装后，加入0.1% DEPC，摇床过液。高压。（115℃，15分钟）。

此产品有些轻微黄色，但不影响使用。

稀释时请用DEPC处理过的水。

 

SYBR Green II（10000×） R0928

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SYBR Green II（10000×） Jinpan R0928

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SYBR Green II（10000×）

SYBR Green II RNA染料是一种高敏感的核酸染色试剂，可以对RNA或者是单链的DNA进行染色。使用300nm透射光显影的情况下，非变性凝胶中检测核酸的灵敏度可以达到5×10-7克。与传统的EB染料相比SYBR Green II RNA染料的灵敏度更高，可以应用于杂交前RNA质量的检测，同时不会影响后续的转膜，还可应用于变形梯度凝胶电泳（DGGE）和单链构象多态性分析（SSCP）等实验。SYBR Green II RNA染料可以代替银染和EB染色，消除了银染复杂、费时的缺点；与EB染色相比，形成的SRBR Green II -RNA复合物所激发的荧光是EB-RNA复合物激发荧光的7倍。SYBR Green II RNA染料并不是特异性的结合RNA或者DNA单链，但是其对单链的结合效率是双链的约2倍，广泛的应用于RNA的质量分析中。

染色方法：

SYBR Green II RNA 染料检测核酸时即可预染也可以电泳后再进行染色。做预染使用时，取1ul贮存液加入1ml TE缓冲液或者灭菌双蒸水中混匀，再加入1ml 的6-loading buffer上样缓冲液混匀（此时溶液为1：2000稀释，即为工作液）电泳时取1-2ul工作液和5ul电泳样品混匀后直接上样。注意：须将商品化的核酸MARKER作一定倍数的稀释（1/5-1/10），这样才能得到比较理想的结果。

电泳后染色。电泳后，在室温、避光的情况之下准备染色液。染色液要在塑料器皿中制备而不要在玻璃器皿中，因为玻璃表层对该试剂有吸附作用。

染料取出后室温放置，恢复室温后简单离心混匀。

染色液使用1×TBE缓冲液进行1：10，000稀释。如果是琼脂糖甲醛变性胶，用1×TBE做1：5，000的稀释。由于SYBR Green II RNA染色液灵敏度高，所以要选用新鲜的1×TBE缓冲液进行稀释，以免缓冲液中残存的杂质产生背景，影响实验结果。注意：为了提高染色的灵敏度，要确定缓冲液的PH值在7.5和8之间，因为SYBR Green II RNA染色液对PH敏感。

把胶放在塑料的染色容器中，加入足够染色液使之覆盖整块胶。用铝箔遮盖或者是放在暗处避光。在染色之前没有必要先将胶中的变性剂如尿素和甲醛洗出来，因为SYBR Green II RNA染色液复合物发出的荧光在甲醛或者尿素存在时不会猝灭。

在室温下轻轻摇晃凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的*染色时间是10-40分钟，琼脂糖凝胶的*染色时间是20-40分钟。染色时间也可能随着凝胶的厚度和浓度变化。由于其荧光本底很低，凝胶染色后无需脱色。染色工作放在2-8°C避光保存，可以重复使用3-4次。注意：SYBR Green II RNA染色液不影响RNA向膜上的转移和northern中的后续实验。

染色胶显色和成像：SYBR Green II RNA染色液复合物所激发的荧光可以使用300nm和254nm光波照射，通过Wratten 15 滤光片检测。注意：由于荧光本底较低，所以可以通过适当延长曝光时间的方法检测痕量的核酸。

请带手套操作。

贮存

SYBR Green II RNA染色液保存于DMSO溶液中，此贮存液于保存温度为-20°C，放置于避光干燥器中，在以上条件下，可在保存一年。稀释工作液在2-8°C可以放置一周，在室温放置3-4天。

 

SYBR Green I（20×）定量PCR用 D0033

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SYBR Green I（20×）定量PCR用 Jinpan D0033

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SYBR Green I（20×）定量PCR用

SYBR Green I与dsDNA 结合荧光信号可增强800—1000倍。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，荧光信号增强，而不掺入链中的SYBR Green I染料分子荧光不变，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。荧光可以在退火阶段或者延伸阶段测定。

使用浓度对荧光PCR结果的影响

SYBR Green I荧光定量PCR的试验成功有很多因素，但是SYBR Green I的使用浓度是非常关键的因素，如果SYBR Green I的浓度过低会使荧光信号的变化降低。这就意味着低拷贝的样品可能无法检出；而在高浓度时，将会抑制PCR反应。降低PCR反应效率。所以一般在使用SYBR Green I时应根据实际情况优化使用浓度。

我们提供的为20×的浓缩液，使用时可稀释20—100倍，即使反应的终浓度为1×到0.2×之间。

镁离子浓度的影响

提高镁离子浓度可以降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用。我们建议在用SYBR Green I进行荧光PCR反应时，镁离子浓度要比无SYBR Green I 的普通 PCR 反应要高出 0.5 到3mM。

 

膜再生液 P0380；西宁供应膜再生液 P0380

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上海金畔生物科技有限公司供应膜再生液 Jinpan P0380量大优惠，咨询 ：

 

 

 

 膜再生液 Jinpan P0380

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膜再生液有些公司叫做一抗二抗去除液，用于对同一张膜进行多次 Western Blot检测。

在室温条件下，将用过的膜浸泡在膜再生液
30-60分钟，可在不影响抗原蛋白的情况下清除膜上结合的抗体。随后，可以使用不同的抗体
进行下一轮 Western Blot实验，因而可利用同一张膜进行多次蛋白检测。适宜从少量样品多次
检测多种不同蛋白质。即使样品量并不匮乏，采用这一策略多次检测同一张膜上的蛋白，能省去
给药处理、蛋白电泳和膜转移等耗费性步骤。
本产品特点是：无毒无害，室温下使用，室温下保存；可对同一张膜进行 10次以上的
Western Blot检测。 适用于清除硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上结合的抗体，不影响抗原蛋白。

1、膜再生的实质是在不影响膜上结合的抗原的条件下，将与抗原分子结合的一抗和二抗洗脱下来。有许多因素影响抗体从膜洗脱，如膜类型、抗体类型和浓度及其与抗原结合特性。按下面的说明优化再生液中孵育膜的时间至关重要。
2、确定膜上抗体是否去除与优化再生液孵育膜的时间：用 ECL 荧光工作液孵育再生后的膜约 1
分钟，然后进行 X光胶片曝光并显影，可确定膜上的抗体是否*去除。如胶片上显示条带，表
明抗体未*去除，应继续将膜浸泡在再生液中另外孵育 30-60 分钟。然后再次 ECL 检查膜上抗
体是否去除。重复此步骤直到抗体*去除并确定*孵育时间。
3、由于至今尚不清楚的原因，使用脱脂奶粉封闭的膜要比使用 BSA封闭的膜上的抗体更容易被
洗下来。因此准备进行再生的膜，应该使用脱脂奶粉而不是 BSA封闭。
4、尽量避免使用干燥保存的膜，干的膜上的抗体很难被洗干净。

 

膜封闭液 P0370；沈阳供应膜封闭液 P0370

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膜封闭液 Jinpan P0370

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我公司生产的Western Blot膜封闭液采用经典的脱脂奶粉加入PBS本制，加入侵。02%的叠氮钠，适于在Western Blot实验中封闭转印膜上非蛋白质结合部位，减少一抗及二抗蛋白的非特异性结合，将实验背景降到zui低。该封闭液对 Nitrocellulose、PVDF、尼龙膜等各种转印膜均有较强的封闭效果。

此试剂一般现订现生产，客房拿到手后须一个月内使用。为节省成本，本产品一般可反复使用两到三回。

 

 

 

ECL超敏发光液 P1160；长春供应ECL超敏发光液

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ECL超敏发光液 Jinpan P1160

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ECL超敏发光液使用说明

试剂组成

P1260-25ml

P1260-100ml

P1260-250ml

ECL超敏发光液A

12.5ml

50ml

125ml

ECL超敏发光液B

12.5ml

50ml

125ml

保存条件：2－8度保存有效期12个月

 

 

产品简介

 

ECL化学发光液在HRP的催化下发生化学反应而发光，可用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子。使用照相技术（X-光胶片曝光）或者其他成像方法（如荧光或化学发光成像仪）进行检测。

我们的ECL超敏发光液是在普通的化学发光液基础之让改进而来，相对于普通发光液来说，灵敏度更高，检测下限更低，可达到pg级别的抗原，并且一抗和二抗的稀释度更高。

本产品在5分钟后光强达到zui大，在30分钟时光强还能维持80%（以5分钟时光强为基础）。zui终发光时长可达一小时。

操作步骤

1.在二抗孵育完毕后，将发光液从冰箱取出到室温平衡。将印迹膜充分洗涤。

2.根据需要量，将ECL超敏发光液A和ECL超敏发光液B按照1：1的比例等体积混合，配制为化学发光检测底物工作液（例如：一张8cm×6cm的膜使用2ml工作液，为节省试剂，初次实验可用洗涤缓冲液测试，以zui少的液体盖住整个膜的表面）。

3.弃去洗涤缓冲液，转移到暗室或者避光盒里操作，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖整张膜，室温孵育5分钟。

4.去掉多余发光底物工作液，将印迹膜置于两层干净的塑料薄膜之间，此过程应小心完成，避免膜与膜之间产生气泡。

5.在暗室内进行X-光胶片曝光，或将膜放置到荧光、化学发光成像仪内，按照仪器说明书进行检测。

6.因本产品发光发光超度高，发光时间长，所以为得到理想的结果，可多次曝光（不同时长）以得到理想的结果。

注意事项

1.为获得*实验结果，请务必优化实验条件，包括检测样品的用量、一抗、二抗稀释度、杂交膜及封闭试剂的选择，并且发光液请现用现配。

2.建议在封闭缓冲液及所有抗体稀释液中加入高质量的吐温-20（终浓度为0.05%），以减少非特异性结合。

3.由于叠氮钠是HRP抑制剂，在缓冲液中应避免使用叠氮钠作为防腐剂。

4.免疫印迹实验进行全过程中，请确保印迹膜始终处于湿润状态，避免干燥。

5.在与膜发生接触过程中请佩戴手套或者使用洁净镊子，避免蛋白污染。

6.实验过程中，请使用洁净器材。保证非金属设备没有明显划痕，金属设备表面无锈。锈可能导致膜上带有污点或者高背景。

 

Western blotting检测试剂盒（ECL发光） P0960

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 Western blotting检测试剂盒（ECL发光） Jinpan P0960

 

 

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Western blotting检测试剂盒（DAB） P0910

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P0910

Western blotting（小鼠IgG）DAB检测试剂盒

920

P0920

Western blotting（兔IgG）DAB检测试剂盒

920

P0930

Western blotting（山羊IgG）DAB检测试剂盒

920

试剂盒组成
1. 封闭试剂：30g（可配制400ml）脱脂奶粉及其他蛋白，缓冲盐等混合物。
2. 10倍浓缩抗体稀释液，50ml。
3. HRP标记二抗，0.5ml，效价1：400。
4. DAB显色液（20×），5ml A+5ml B。

原理：

SDS-PAGE电泳后，蛋白质按照分子量大小分离，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性的蛋白。

操作步骤：

常规电泳转膜后，
1） 清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T漂洗3次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。
2） 按5g封闭试剂加100ml双蒸水计，配制膜封闭液，配好的膜封闭液为乳白色悬液，将漂洗过的转印膜，封闭液内，摇床震动，室温封闭30min。 A@ 3） 用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。
3）将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×（10ml 10×抗体稀释液加入90ml双蒸水，混匀，可4℃保存三个月）。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。
4）用1×的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育过液或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪成条，分别作好标记，分开孵育。
5）用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。
6）用稀释好的抗体稀释液稀释抗体。根据用量，按10ml抗体稀释液加入10ulHRP标记二抗的比例，配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中，加入加入二抗工作液，封口，4℃孵育过液或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。
7）用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次10min。
8）配制DAB显色：根据用量，取TBS-T  4ml，加入DAB显色液A、DAB显色液B各200ul，混匀，加在膜正面，室温下显色。在目标条带显出后，而且背景未出时，放入水中终止显色。

注意事项：
1，   请根据一抗来源选择试剂盒。括号里面代标一抗的来源而不是标本的来源。
2，   western blotting DAB显色法操作简单，但其敏感性与ECL发光发有一定的差距，一般只适用于丰度较高的蛋白。
3，   可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深，可延长膜封闭时间，加长zui终漂洗次数与时间。如果条带过弱，可延长抗体孵育时间。
4，   如果*没有条带，请检查前期蛋白处理及实验过程， 如果确认无误，反复两次依旧无结果，请换用ECL发光法显色。
5，   TBS-T（0.01M）配制方法：称取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的双蒸水溶解，用盐酸调PH到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用双蒸水 加至1000ml，混匀即可。（也可按照自己的配制习惯来配制）

 

TBST（TBS-T） P0340；长春供应TBST（TBS-T） Noble

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 TBST（TBS-T） Jinpan P0340

 

 

 

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1M Tris-HCl pH7.5  10ml

NaCl              8.8g

吐温20          0.05%
此产品用于免疫印迹膜的清洗。

 

线粒体提取试剂盒 P0940；兰州供应线粒体提取试剂盒

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线粒体提取试剂盒

50T

320.00

线粒体提取试剂盒

100T

580.00

 

线粒体提取试剂盒使用说明

 一，试剂盒组份

组份

P0940 （50T）

P0940 （100T）

Lysis Buffer

50 mL

100 mL

Mito-Wash Buffer

25 mL

50 mL

Store Buffer

5 mL

10 mL

二，说明

线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。

三，操作步骤

1. 样本处理

a. 组织匀浆：称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次；

b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要5 × 107个细胞，加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000× g 离心5 min；

3. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000× g 再次离心5 min。

4．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

5. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；

6．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

6. 用50 -100μL Store Buffer 或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。

四 注意事项：
1. 为保证获得完整的线粒体，*是全程低温操作。第二是快速。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的zui关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。

五 储存：四周内使用可4℃储存，长期置-20℃

转速与离心力换算

G＝1.11×（10-5）×R×[rpm]２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；

 [rpm] ２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。