以极低起始量模板（单细胞/细胞核或 2 pg 总 RNA）制备 RNA-seq 文库
以最低起始量为 10 ng 的总 RNA 进行 5’RACE
降低 RNA-seq 或 5’RACE 的背景
该酶混合液包含小鼠 RNase 抑制剂，不需要额外添加
兼容各种模板置换寡核苷酸（TSOs）、反转录引物和 DNA 聚合酶,用于扩增全长 cDNA
与其他的 RNA-seq 方法（例如:Smart-Seq）相比，操作更快捷
模板置换反转录酶混合液中的反转录酶（RT）在其到达 RNA 模板的 5’末端后会添加几个非模板源的核苷酸。这几个非模板源的核苷酸可以与已知序列的模板置换寡核苷酸（TSO）退火，促使反转录酶从 RNA 模板上切换到 TSO 上。得到的 cDNA 含有 3’末端添加有已知序列（TSO 的互补序列）。该特征可用于多种下游应用，例如 cDNA 扩增、5’RACE（cDNA 末端快速扩增）和第二链 cDNA 合成。说明书中有优化的实验流程。
图 1：模板置换流程概览
当到达 RNA 模板的 5’端时，反转录酶会在 cDNA 的 3’端添加几个非模板源的核苷酸。这些非模板源的核苷酸可以与包含已知序列的模板置换引物退火,从而促使反转录酶从 RNA 模板上切换到 TSO 上。所得到的 cDNA 在 3′ 端包含一个通用序列（TSO 的互补序列）
图 2：在单细胞 RNA-seq 实验中,模板置换反转录酶混合液相对于 Smart-seq2 方法的优势
gA.模板置换介导的 cDNA 扩增概述。反转录引物含有 5’接头，它与 TSO 一起在 cDNA 的 5’和 3’末端添加接头。之后可用识别接头序列的引物 PCR 扩增全部反转录产物。
B-D.使用 NEB 模板置换反转录酶混合液或 Smart-seq2 方法(Picelli, S. et al.(2014). Nat. Protoc. 9, 171-81)，用 10 μg Universal Human Reference（UHR） RNA （Agilent）与 ERCC RNA Spike-In Mix I（Thermo Fisher Scientific）生成 cDNA 文库。然后使用 NEBNext® Ultra™ II FS DNA 文库制备试剂盒（NEB＃E7805）将每个 cDNA 文库制成 Illumina 文库，并在 Nextseq 500 上使用 2 x 75 个循环测序。将测序采样 2 x 1.2 M 个 reads（除非另有说明），去掉接头 reads，并且使用 Prinseq 过滤。B.显示的是样品总 reads（Total reads）、去掉接头的 reads（Trimmed reads）和通过 Prinseq 过滤的 reads（Filtered reads）。插图列举了每种方法制备的 cDNA 文库的 Agilent Bioanalyzer 2100 结果。虚线框标注了非特异片段。C.使用 Salmon 将过滤的 reads 与 GENCODE 28 和 ERCC 转录物比对。图中的点表示从每个文库检测到的 TPM（每百万转录数）≥1 的转录物的数量作为测序深度。 D.使用 Hisat 2.0.7 将过滤的读数与 hg19 人参考基因组比对，并使用 Picard SAM / BAM RNA Seq Metrics 工具计算 RNA-seq 指标。该图显示了分布于外显子（红色），rRNA（橙色），内含子（绿色），基因间区域（蓝色）的匹配 reads 和不匹配 reads（灰色）的百分比。
图 3：模板置换反转录酶混合液在 5’RACE 的实验中操作简单,性能优异
A.模板置换介导的 5’RACE 概述。在模板置换反转录反应后，用反向基因特异性引物和正向 TSO 特异性引物进行 5’RACE PCR。
B.使用 NEB 模板置换反转录酶混合液 5’RACE 方案（左）或 Clontech SMARTer 5’/3’RACE 试剂盒（右）对多种 RNA 靶标的 5’RACE 产物进行琼脂糖凝胶分析。加入 1 μg 的 Jurkat 总 RNA，10 pg 的 8 kb 合成 RNA 和 10 ng 的 ERCC RNA Mix 1，用于评估作为转录物长度和拷贝数的性能。在 NEB 的反应中，反转录引物为 oligo (dT)40 VN，TSO 为 GCTAATCATTGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG，TSO 中特异性 PCR 引物用下划线标注。两种方法使用相同的基因特异性 PCR 引物。靶标名称和预期片段长度如图所示。
图 4：模板置换反转录酶混合液在第二链 cDNA 合成中操作简单，且可捕获完整的 5’末端转录产物
A.模板置换介导的第二链 cDNA 合成概述。在反转录反应后，RNA 模板水解，使用 TSO 作为引物延伸合成第二链 cDNA。
B.使用 1 kb 的合成 RNA 作为模板，使用 poly（dT）40 VN 作为第一链 cDNA 合成的反转录引物。使用模板置换介导的方法或 Gubler 在文献中描述的方法—R and Hoffman,BJ.(1983) Gene,25,263-269，对第二链 cDNA 合成进行三个平行实验。所得到的双链 cDNA 产物使用反向引物用 Sanger 法对第二链 cDNA 进行测序。结果显示模板含有转录起始位点（TSS），并标注出了匹配序列。 添加到 cDNA 末端的 TSO 序列用灰色标注。未通过 Gubler 和 Hoffman 方法检测到的序列用蓝色标注。不可信读序区用黄色标注。
随产品提供的试剂
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储存温度(℃)
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浓度
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模板置换反转录缓冲液
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-20
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4 X
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产品类别：
cDNA合成和反转录产品
PCR，qPCR 和 扩增技术产品
应用
cDNA 合成
RNA 分析
储存温度
-20°C
